血检TMB丨非小细胞肺癌患者中，高ctDNA TMB的患者PFS和OS越短？
2019年初，《Nat Genet》上一篇文章研究表明：基于组织样本检测的 tTMB-H 患者接受 ICIs 治疗的总体生存率更好[1]。但是，基于血液检测的 ctDNA TMB-H（或bTMB-H）患者，是不是接受 ICIs 治疗的总体生存率也会更好呢？
本次介绍的回顾性研究答案是否定的[2]。与以往研究的tTMB相比，在这次的测试样本中，较高的ctDNA TMB与较短的PFS和OS显著相关。这是为什么呢？（这项研究也与去年《Nat Med》报道的 Atezolizumab 治疗NSCLC的B-F1RST前瞻性数据形成了对比[3]）
临床研究显示，单独使用PD-1/PD-L1抑制剂，只有20-40%的病人会对免疫治疗产生反应[4,5]。识别对PD-1/PD-L1抑制剂有反应的患者的生物标志物是至关重要的。组织肿瘤突变负荷（tTMB）已成为预测PD-1/PD-L1抑制剂治疗反应的一种可行的生物标志物，但很少有研究探讨基于血液的无创TMB（ctDNA TMB/bTMB）的意义和潜在的临床意义。
在非小细胞肺癌中，通常要做诸多分子检测，例如EGFR，ALK，NTRK突变等，这就会导致组织标本的紧缺，大约有30%的患者无法再进行标准的组织NGS检测，尤其在晚期肿瘤患者中很难获取（足够的）组织用于分子检测，这时非侵入性的血检就是一个非常好的替代手段[3]。考虑到获取足够的组织与非小细胞肺癌系列活检相关并发症发生率的技术挑战，探索并建立ICIs反应的非侵入性生物标志物是至关重要的。
因为ctDNA是在肿瘤细胞生长到供血不足、缺氧、凋亡或坏死后主动释放到血液循环系统中的[6]，因此基于血液ctDNA的 TMB 检测将会是一个新的生物标志物，本次介绍的就是ctDNA TMB在非小细胞肺癌中的临床应用前景。
▲ Oncologist 2019 Mar 13（PMID：30867242）
在非小细胞肺癌中，基于NGS panel检测的组织肿瘤突变负荷（tTMB）已经成为预测免疫检查点抑制剂 PD-1/PD-L1 免疫药物临床治疗反应的潜在生物标志物，但是利用血液循环肿瘤DNA（ctDNA）检测的血液肿瘤肿瘤突变负荷（bTMB/ctDNA TMB）还是比较少的。
材料与方法对136例接受ctDNA检测的非小细胞肺癌患者进行回顾性评估，并与来自第二家机构的验证队列进行比较。ctDNA TMB是利用NGS测序检测到的突变数推导出来的。
检测的材料：2015-2016年的样本，一线接受免疫治疗前或接受免疫治疗后90天内采血，2管streck 10ml外周血；
ctDNA抽提试剂盒：Qiagen circulating nucleic acid kit；
检测的产品：Guardant360，68基因（2015.05-2015.10）和升级后70基因（2015.10-2016.10）的panel；目前，Guardant360 检测方法还没有被临床验证来确定TMB，本文提供的分析仅用于研究目的（现在Guardant360是73基因，并在2018年2月获得美国FDA的快速审批资格，有望成为首个FDA批准的全面液体活检产品[7]）
检测panel大小：检测约 13.8 万个碱基，即约 0.138 MBp；
检测仪器：Illumina HiSeq 2500 ；
测序深度：平均深度是≥15000X；
临床敏感性：85%；
临床特异性：>99%；
ctDNA TMB的算法：ctDNA TMB被定义为在已测序的ctDNA区域内检测到的突变数量，使用检测 panel 编码区的 SNV 及 indel 突变（排除重排、融合和拷贝数变异），计算患者的ctDNA TMB，表示为：突变数/MBp。ctDNA TMB是通过三种不同的方法计算的：
方法一：VUS（意义未明变异）+ 同义突变；
方法二：VUS（意义未明变异）+ 非同义的潜在功能变体；
方法三：VUS（意义未明变异）+ 同义突变 + 非同义的潜在功能变体。
三种方法检测的 ctDNA TMB 中位数分别为 14.5/MBp，7.2/MBp，21.7/MBp；本次分析使用的ctDNA TMB分析方法是方法一（除非有其他特别说明）。
▲ ctDNA TMB的三种不同计算方法
▲ 基于包含所有检测到的突变的人群中TMB评分的情况（方法一）
在136例患者中，影响（方法一）计算ctDNA TMB值的因素有年龄及吸烟史。性别、肿瘤组织学类型、样本采集时的疾病阶段、先前的治疗路线、先前的放射治疗以及EGFR或KRAS的突变与此次ctDNA TMB值均无太大影响。
PFS和OS分析：PFS和OS的评估采用 Kaplan-Meier 评估法，基于免疫治疗起始日期，患者在2017年1月18日再次被审查：PFS（进展）或最后随访，OS（死亡）或最后随访。
研究的结果一、高ctDNA TMB与吸烟史呈显著正相关。然而，这项研究并没有发现 C> A 突变的优势（这在以前有吸烟史非小细胞肺癌患者的研究中，报道的更频繁）[8]，因此ctDNA TMB和吸烟史之间的关系应被视为初步的研究结果。
二、在接受免疫检查点抑制剂治疗的患者中（n=20例），较高的ctDNA TMB与较短的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）显著相关：ctDNA TMB-H 的患者 PFS 显著缩短（红色曲线）（图A，45天 vs 355天），ctDNA TMB-H 的患者 OS 显著缩短（红色曲线）（图B，106天 vs 未达到）。
▲ n=20，基于ctDNA TMB的 ICIs 治疗患者的PFS和OS
在一个小的独立验证队列中（n=12例），ctDNA TMB越高，预测 OS越短，而PFS则不是（数值差异不显著）：ctDNA TMB-H 的患者 PFS （红色曲线）与 ctDNA TMB-L的患者PFS（蓝色曲线）无差异（65天 vs 64天），ctDNA TMB-H 的患者 OS 显著缩短（红色曲线）（236天 vs 511天）。
▲ n=12，基于ctDNA TMB的 ICIs 治疗患者的PFS和OS
三、同时，本研究还发现，在接受免疫检查点抑制剂治疗的患者中（n=20例），较高的 MAF（突变等位基因频率，Mutant Allele Frequency，可以理解为基因的突变频率）与较短的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）显著相关：MAF-H（红色曲线）与较短的PFS显著相关（图A，51天 vs 355天），MAF-H（红色曲线）也与较短的OS显著相关（图B，135天 vs 未达到）。在验证队列中（n=12例），MAF越高，预测 OS越短，而PFS则不是（数值差异不显著）：MAF-H 的患者 PFS （红色曲线）与 MAF-L的患者PFS（蓝色曲线）无显著差异（图C，44天 vs 114天），MAF-H 的患者 OS 显著缩短（红色曲线）（图D，236天 vs 595天）。
▲ 基于MAF 的 ICIs 治疗患者的生存曲线，包括PFS和OS
ctDNA MAF 可能反映肿瘤负荷，对接受靶向治疗或PD-1/PD-L1治疗的患者具有实时监测的潜在作用。ctDNA MAF是较短OS的预后标志物。
研究的结论在目前的商业检测 panel 下（Guardant360），较高的ctDNA TMB反映了NSCLC患者较差的临床结果（PFS和OS）。
为什么ctDNA TMB-H的NSCLC患者，
接受PD-1/PD-L1免疫治疗的PFS和OS就越差呢？
1，机制假说，更多的组织基因突变可能预示着肿瘤产生更多的新生抗原，诱导肿瘤周围细胞毒性T淋巴细胞的流入。然而，ctDNA TMB的生物学特性可能会有很大的不同，因为ctDNA只有在肿瘤将ctDNA转移到血液中时才能被检测到。以前的研究表明，ctDNA的数量可能预示着更严重的疾病和更高的整体肿瘤负荷。在转移性乳腺癌的常规治疗中，较高的ctDNA突变负荷与较短的进展时间有关[9]。因此，相对于细胞毒性效应T细胞的新抗原位点，ctDNA TMB本身可能反映了更大的肿瘤负荷。
2，该研究者在以前配对的患者样本中发现组织TMB（tTMB）和ctDNA TMB（bTMB）之间的相关性较低，了解不同测序技术比较的局限性（与组织相比，血液中ctDNA的含量很低，这在检测方面也存在很大的局限性。为了评估ctDNA与tTMB的一致性，有必要进行前瞻性研究，探索具有更多突变的更长的ctDNA检测panel），这可能表明 tTMB 与 bTMB 这两个生物标志物是差异预测因子[10]。
3，先前的研究表明，肿瘤负荷与更大的肿瘤异质性相关[11]。在肿瘤负荷较高的患者中，可能有更多的ctDNA进入血液，从而检测到更多的ctDNA，ctDNA突变负荷可能更能反映肿瘤内异质性，更好地反映TMB的整体情况，这是组织活检固有的局限性。先前的多项研究已经证明突变亚克隆性是一种与低存活率相关的生物标志物[12,13]，假设ctDNA TMB的异质性更大（例如，更高），MAF定量反映肿瘤体积较大，提示接受PD-1/PD-L1治疗的患者预后较差。
4，这是首次利用商业上可用的检测方法将 ctDNA TMB 作为非小细胞肺癌患者的生物标志物进行检测的研究之一。这个研究有几个局限性：
✦ 首先，本次研究中使用的 ctDNA 检测panel是 Guardant360 68/70基因panel，panel的size比较小，只有 0.138MBp，因此在估算ctDNA TMB时，可能不能反映组织癌基因组的体细胞突变率（tTMB检测的panel建议＞0.5MBp，一般在1.0MBp以上最好）。
▲ 目前的建议包括使用实体组织样本，使用覆盖率大于0.8 MB（最好大于1 MB）的基因panel
✦ 其次，本次的研究结果只反映了单个商业可用平台的ctDNA TMB，因此检测血液基因组变化的检测技术规范可能不反映其他ctDNA检测平台（比如Foundation，PGDx ctDNA检测平台）。
✦ 再次，本研究将ctDNA TMB作为PD-1/PD-L1的预测因子，用于生存分析的样本量很小。
✦ 最后，本研究在分析中结合了几种抗PD-1/-PD-L1的治疗方法，进一步的研究应该在更大的队列中分别探索每种抗PD-1/PD-L1抑制剂的疗效。
总之，此次研究结果证明了在非小细胞肺癌患者中检测ctDNA TMB的可行性。有趣的是，与组织相比，此次分析表明，对于接受免疫检查点抑制剂（PD-1/PD-L1）治疗的患者，较高的ctDNA TMB与较短的PFS和OS相关，这可能是由较高的肿瘤负荷介导的。同时，MAF作为反映血液高突变和肿瘤异质性的无创预后生物标志物，可作为非小细胞肺癌免疫检查点抑制剂反应的标志物。
参考资料：
1. Samstein Robert M,Lee Chung-Han,Shoushtari Alexander N et al. Tumor mutational load predicts survival after immunotherapy across multiple cancer types.[J] .Nat. Genet., 2019, 51: 202-206.
2. Chae Young Kwang,Davis Andrew A,Agte Sarita et al. Clinical Implications of Circulating Tumor DNA Tumor Mutational Burden (ctDNA TMB) in Non-Small Cell Lung Cancer.[J] .Oncologist, 2019, undefined: undefined.
3. Gandara David R,Paul Sarah M,Kowanetz Marcin et al. Blood-based tumor mutational burden as a predictor of clinical benefit in non-small-cell lung cancer patients treated with atezolizumab.[J] .Nat. Med., 2018, 24: 1441-1448.
4. Brahmer JR, Tykodi SS, Chow LQ et al. Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer. N Engl J Med 2012;366:2455–2465.
5. Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR et al. Safety, activity, and immune correlates of antiPD-1 antibody in cancer. N Engl J Med 2012;366:2443–2454.
6. Jahr S, Hentze H, Englisch S et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: Quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancer Res 2001; 61:1659–1665.
7. The Guardant360 Assay Receives Expedited Access Pathway Designation for Breakthrough Devices From FDA
8. Govindan R, Ding L, Griffith M et al. Genomic landscape of non-small cell lung cancer in smokers and never-smokers. Cell 2012;150:1121–1134.
9. Maxwell KN, Soucier-Ernst D, Tahirovic E et al. Comparative clinical utility of tumor genomic testing and cell-free DNA in metastatic breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2017;164:627–638.
10. Davis AA, Chae YK, Agte S et al. Comparison of tumor mutational burden (TMB) across tumor tissue and circulating tumor DNA (ctDNA). J Clin Oncol 2017;35(suppl 15):e23028.
11. Burrell RA, McGranahan N, Bartek J et al. The causes and consequences of genetic hetero geneity in cancer evolution. Nature 2013;501: 338–345.
12. Jamal-Hanjani M, Wilson GA, McGranahan Net al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 2017;376:2109–2121.
13. Gerlinger M, Rowan AJ, Horswell S et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 2012;366:883–892.
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